国际协会主席建议停止验证韩春雨实验

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    赛先生今晨报道“多国科学家宣布：迄今未能重复韩春雨NgAgo实验结果”，知社发表“争议升级: ISTT质疑韩春雨实验可重复性, 确遭专家质疑其权威性”，国际转基因技术协会原主席Montoliu今天向协会会员发信，建议停止验证河北科大韩春雨实验，不要再浪费时间、金钱和人员。国内亦有专业人士也在新浪微博公开质疑国际转基因技术协会权威性。
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国际协会主席建议停止验证韩春雨实验，不要再浪费时间、金钱和人员
国际转基因技术协会原主席Montoliu今天向协会会员发信，建议停止验证河北科大韩春雨实验，不要再浪费时间、金钱和人员。针对该技术调查表明，140个回复中，只有一个（中国神经所仇子龙）回答有效，73 个无效，63 个在验证。
挑战的是最为流行的技术，研发者来自中国一所并不出名的高校，有望冲刺诺奖，NgAgo-gDNA技术一现于世，就带有诸多话题性。最近一个月，是否可重复的争议更把NgAgo-gDNA推向另一个火山口。作为基因编辑的新工具，NgAgo-gDNA技术是否具有操作性？若干国内外的实验室正在进行检验，但尚未有实验室宣布重复成功。
最新的消息来自澳大利亚国立大学的基因学家Gaetan Burgio。7月21日晚， Gaetan Burgio在个人Twitter上和网友交流他的研究动态。Gaetan Burgio表示，在小鼠受精卵上重复韩春雨的实验后，他看到有序列发生插入缺失，且和目标序列有相似性，这意味着基因组可能发生了编辑。但他同时提到，目前无法排除这一现象是否是由引物二聚体或质粒的问题引起，并且Gaetan Burgio得到的序列存在部分紊乱的情况，需要重新实验才能下定论。
这比Gaetan Burgio预期的复杂。之前7月15日，他的一则Twitter被人认为是确认重复实验成功。实际上，那只是PCR测序的结果，这一结果的确让Gaetan Burgio感到鼓舞，但21日的Sanger测序结果显示却很混乱。“就我所做的实验而言，我还不能明确地下结论。” Gaetan Burgio写道。
7月15日，Gaetan Burgio发Twitter表示，初步PCR的结果显示，在小鼠上做NgAgo实验有效。
类似这样“反转”的情况并不只是Gaetan Burgio的实验。7月6日，有消息称，新德里的基因与综合生物学研究所的Debojyoti Chakraborty博士已经成功重复实验，但事后Chakraborty博士回邮件称，需等到基因测序结果出来后才能下结论。
国内也有实验室传出已经成功重复。20日下午，北京交通大学计算机与信息技术学院教授刘峰在科学网发表博文称：“我刚和上海神经所@仇子龙研究员确认，他重复了河北科技大学韩春雨老师的试验。”
但在21日上午，中国科学院上海神经科学研究所研究员仇子龙在自己的微博认证账号“求导”上发文，表示实验室仍在重复，优化各种条件，目前的实验结果距离韩春雨论文中的结果“相差甚远”，并呼吁韩春雨提供“可重复NBT发表文章的NgAgo，或者优化的Ngago2.0，smart版本等等”。
仇子龙之所以这么呼吁，是因为此前，面对可重复性质疑时，韩春雨在各类报告上回应称，需要“高超的实验技巧”。这和Gaetan Burgio的猜测有所吻合。Gaetan Burgio认为，如果实验是可重复的，可能是试验中有一些“技巧”被人忽视了，才导致迟迟无法重复实验。
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韩春雨就方舟子及网友提问发文回复
就方舟子公开发文质疑韩春雨"诺奖级"实验成果的可重复性问题，而对于方舟子和部分网友的质疑，韩春雨也于7月2日在百度贴吧上做出了回应。
网友发文提问：
韩春雨老师用自己的"槐北路"的账号进行了回复：
对于方舟子和网友们提出的质疑，韩春雨在该回复里进行了详解解答：细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原体污染(Ago系统对污染特别敏感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下，单转guid不会影响GFP表达，假阴性也大多因为细胞污染，假阳性和假阴性我都遇到过，国内买的细胞我就不吐槽了)，转染用的质粒质量要好(可用30ngGFP转细胞，若是均一且效率高表明质量好，强弱不均一则表明质量差，越不均一表明质量越差)，guide磷酸化完全(没有磷酸化不能load和切割---谢谢印证我的Fig2结果，至于怎么检测，自己跑个PAGE看看---)
质疑：目前还未见有人反映重复出了图4结果。
韩春雨的回复：也是几乎惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密度和用血清控制细胞生长，时间稍长，毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化---照着online method上protocol for genome editing and T7E1做(小经验，PCR最好不要有引物二聚体，如果引物二聚体多请重设引物CR产物直接回收最好不跑胶回收，可能跟ago切24bp有关，设好对照!)---银染分辨率高，可以排除T7E1假阳性，能做出预期条带后请用PCR产物去测序。欢迎大家广泛使用此系统，并分享成功经验和失败教训。附，addgen上的质粒，可以直接用作基因组编辑。再次强调，不加NgAgo，就能抑制GFP，是假阳性，是细胞出问题了(谢天谢地不但我自己而且审稿人也有这个对照)出现假阳性的细胞切基因组就没戏了。对于Fig4，若是不习惯做银染，也可以直接做KI：doner 用GFPcoden+polyA signal，前后加几个保护性的碱基---从GFP-N1扩出来连到T-vector上，再从此doner-Tvector上扩(防止GFP-N1污染的假阳性)出来纯化，500-800ng共转(for each well of 24 well plate)。
而对于韩春雨的回复，方舟子也做出了回应：那么这种"高超的实验技术"究竟是不是实验细节的处理，不同网友也有自己的看法，有网友表示pcr已经有那么久的历史，且机器已经半自动化，但目前也不是每个人次次都能成功。在实验过程中，技术不难，难的是整个实验过程都不能有半点差错。韩春雨老师经过几年发表出来的结果，而目前大部分实验室也只刚刚尝试几个月。关键一步都没处理好，所以做不出来，但是恰恰是关键的一步 这也是他能做出来成果，别人做不出的原因。
韩春雨老师也强调了无污染的细胞重要性:而对于目前大家较为关注的重复性问题，目前网上虽然有一些表示没有重复出来，一方面韩春雨老师经过几年发表出来的结果，而目前大部分实验室也只刚刚尝试几个月，另一方面一些网友认为目前重复不出来的原因也可能是在这个风口浪尖，为避免惹祸上身，重复出来的人也未必想站出来发声。而且也有网友爆料来自印度的学者Dr. Debojyoti Chakraborty发言已重复出韩春雨NgAgo实验。
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30岁拿到清华教授、博导的美女科学家颜宁对韩春雨实验的评价
        “到了这一步终于变味了。上周组会的点评：
1.我很佩服韩老师，在支持这么差的情况下，坚持科研，真心佩服；
2.希望借此能够关注对于本土培养的青年科学家的支持问题；
3.这个研究如果所有数据solid，前景巨大，好极了；
4.这项研究不属于创新型研究，是跟风型的，没必要神话，原创在2014年。”
考虑到最近的舆论风向，其中最有争议的就是关于创新性的评价。其实韩老师本人对自己这个项目的评价是非常中肯的，他认为，NgAgo仅仅提供了基因编辑的一种选择，并不能取代或超越CRISPR。
没有创新的成果不可能发表在国际一流期刊上，而这项研究确实又不是媒体中、部分学生中流传的基因编辑原理上的原创，显然，有些媒体把这一成果的地位过分夸大的言论，并无不妥。不知道为什么很多人认为这是一次基因编辑方法概念上、方法上的创新，大概是因为有些非专业的同学对基因编辑领域确实不够熟悉。业内专业同仁的评价基本都是接近的，中肯的——都不约而同地提到了这项成果“被神化”的问题。
这项成果最大的贡献在于发现了常温下可以使用的NgAgo，而非发明了DNA介导核酸切割或基因编辑。其在基因编辑技术前景最广阔的两大应用领域（农业和基因疗法），受限于ssDNA本身的性质，也很难达到或与CRISPR相媲美的应用价值。
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ISTT质疑韩春雨实验可重复性
Dear colleagues,
The publication by Gao et al in May in Nature Biotechnology (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27136078) triggered an enormous expectation. This Chinese team led by Chunyu Huan reported that the Argonaute (Ago) protein from a rare haloarchaea, Natronobacterium gregoryi, (NgAgo) would efficiently work for gene editing purposes in human cells. Ago had been described as an DNA-guided endonucleases two years before, through a Dutch-Spanish microbiologist collaborating team (Swarts et al. 2014, Nature: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24531762).
On paper, the new (fourth) Gene Editing system looked great. An endonucleas, using ssDNA guides (5' phosphorylated though) and not RNA guides, without  a PAM, requiring 24 nucleotides (and not 20nt), hence with higher specificity, and apparently with fewer off-target issues, since modifications in just one position of the DNA guide resulted in >90% decrease of the protein activity.
On paper.
I must confess we read the Huan paper in my lab with some disappointment, after two years battling, unsuccessfully, with Ago from Thermus, through a collaboration with my friend and colleague J. Berenguer, from the  neighbouring reserch centre CBMSO, and one of the co-authors of the Nature  2014 paper. We had been scooped. We repeteadly failed to find any gene editing activity using Ago from Thermus thermophilus (TtAgo) in mammalian cells, through a variety of conditions and we didn't understand why, though we always suspected that these proteins would not be too comfortable at "too cold" temperatures as physiological +37C. After reading the Gao paper we concluded we simply missed the right bug and congratulated them for being smarter and lucky and for finding this archaea. Perhaps the trick was in using NgAgo instead of TtAgo.
Shortly after, NgAgo was released from Addgene, beginning of June, many labs, including mine, jumped onto it to try experiencing the anticipated great expectations and joy associated with this new tool of prokaryotic origin. But soon it was clear that something wasn't quite right. Rumours began spreading during June and July at congresses, through social networks, list emails and discussions groups that NgAgo didn't appear to work as reported. Actually, didn't work at all. Some colleagues that I absolutely trust at scientitic and technological levels started to indicate that they could not reproduce Huan's paper results.
At the recent TAGC meeting (where IMGS was contributing to, merging in along with other Genetics Societies) Gaetan Burgio, from ANU, Camberra, Australia, presented some very preliminary data with a gel with some intermediate bands that would suggest NgAgo would be working and editing at the expected places. But, shortly thereafter, Gaetan engaged his lab in an OpenScience project, tried to characterize all these bands and.... found nothing. So, again, another evidence confirming NgAgo is not working as a gene-editing tool.
Gaeatan just released today his experience using NgAgo, openly sharing his failures and providing details and some explanations for them.

My experience with Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo)
Gaetan Burgio
Group leader at JCSMR, ANU
https://medium.com/@GaetanBurgio ... 909b410c#.bo9y6mf9u
At first, KUDOS to Gaetan. Many thanks to him for sharing their efforts trying to confirm some gene-editing activity associated with NgAgo. There is apparently none. In his view, NgAgo might be working as a ligase at physiological conditions. Similar to our negative results using TtAgo it would appear that NgAgo requires some higher temperatures to work as initially reported. This of course seeds some doubts on the Gao et al. publication and Gaetan, among other, is requesting to Nature Biotechnology to request the Huan's lab to reveal and share their raw data. We will see this part of the history how it develops...
But, now, the most important message to convey is: NgAgo does not work for gene editing in mammalian cells. Be aware and do not waste your time, your money, your peoople and projects. If anyone has any positive hint suggesting Ago is indeed working as a genomic editor, please share the results, for the sake of Open Science, as Gaetan beautifully and most generously did. Many thanks to Gaetan!
Unfortunately, this is a great disappointment. But, it also highlights the uniqueness and the robustness of the CRISPR-Cas systems.
Long life to CRISPR!
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多国科学家宣布：迄今未能重复韩春雨NgAgo实验结果
韩春雨论文发表后，在国内外引发强烈关注。在国内，韩春雨受到一些著名科学家和媒体的热捧，甚至被誉为“诺奖级”成果。但此后不久，该事件就陷入持续性争论：有人提出韩春雨的基因组编辑结果无法重复，有人说可以重复但效率低，彼此争论不休、难有定论。
澳大利亚国立大学实验室研究人员发表长篇文章报告其试图重复韩春雨结果的过程，结论是：无法重复，而且与韩论文所说矛盾；《自然.生物技术》应要求韩公布原始数据；该技术没有前途。
截止7月29日，来自澳大利亚、美国、西班牙等国的多位科学家公开表示，无法重复韩春雨NgAgo系统的基因组编辑结果，建议《自然-生物技术》(Nature Biotechnology)杂志介入，要求韩春雨公开原始数据。
发长文质疑NgAgo结果的，正是此前曾宣布可以重复该结果的澳大利亚国立大学研究者盖坦·布尔焦(Gaetan Burgio)。他在7月29日发长文详细叙述他的实验经历，称：尽管他和同事在过去的一个月做了多次尝试，但最终发现，NgAgo无法进行基因组编辑。他说：“与此同时，我从我的Twitter帐户、TAGC大会、E-mail、Google讨论群的多次讨论中发现，很多人都尝试着利用韩春雨的实验步骤对人类细胞株、小鼠或斑马鱼进行基因组编辑，但是不论是使用NgAgo的DNA，mRNA还是蛋白质，他们都未能检测到基因组编辑 ”有鉴于此，他呼吁《自然-生物技术》杂志介入，要求韩春雨公开原始数据。
该公开信一出，立即引起了相关领域科学家的关注和讨论。国际转基因技术协会(ISTT)在其Twitter上推送了布尔焦的文章以及数位科学家的实名评论。前普斯顿大学教授、现就职于美国霍华德休斯医学研究所(HHMI)下属研究机构Janelia Farm的科学家David Stern表示，无法利用NgAgo在果蝇中进行编辑;西班牙科学家Lluis Montoliu称，他们在NgAgo之前就已经利用TtAgo进行了两年的实验，并无法实现基因组编辑。
多位科学家都认为，《自然-生物技术》杂志应当要求韩春雨公开原始数据和具体实验条件。据悉，几位科学家也在考虑将这些负面实验结果近期投放到生物预发表服务器bioRxiv。
为此，记者就此采访了国内多所知名大学的从事或一直关注基因编辑领域的科学家，两位要求匿名的科学家表示，他们按照韩春雨论文中介绍的方法做了多次试验，都未能重复出韩春雨的试验结果。据介绍，他们熟知的多位同行也未能重复出韩春雨的试验结果。另一位不愿具名的科学家说，不止一个实验室发现无论体内还是体外实验，无法检测出NgAgo的核酸内切酶活性，“但是如果NgAgo没有活性，怎么会有那么好的编辑效果?”
外国学者还专门表发关于NgAgo的一些想法：
首先，像很多人一样，多次尝试后，我仍旧没有发现任何证据证明NgAgo能进行基因组编辑。可是，在通常的PCR条件下，我竟然发现NgAgo有类似“连接酶”的活性，而这与韩的文章里所说的内切酶活性没有半点关系。在我看来，NgAgo似乎需要超过50 oC才能发挥作用，这和韩的文章有直接矛盾。
总结所有这些试图重复韩的文章但失败的实验，我认为是由于细胞所处的温度对于NgAgo发挥作用太低了，或者NgAgo或5’磷酸化ssDNA与NgAgo复合物在细胞内被快速降解了，这可能也是为什么没有人能重复韩的实验。NgAgo可能没有：或者只在严格限定的条件下才有内切酶活性，从而使得它几乎不可能被重复；即使它真有活性，也限制了它的广泛应用。此外，我对NgAgo是否真有内切酶活性很怀疑。《自然-生物技术》应该要求韩向公众公开他所有的原始数据和实验条件，这是学术期刊的义务。最后，我强烈相信，不管NgAgo怎样，CRISPR/Cas9系统将长期存在，而NgAgo经过那么多失败的尝试后将被很快遗忘。显然，NgAgo尚没有一个光明的未来。
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韩春雨到底干了什么样的诺贝尔奖级成果，引起如此大的轰动
有人则力挺，认为韩春雨这个 NgAgo是一个基础性的、工具性的大发现、大发明。韩春雨创造了基因编辑的 Microsoft Word 。不久的将来，全球成千上万的生物学研究者、生物科技企业将会使用韩氏编辑器、韩氏工具箱写出一篇篇的论文，开发出各种产品。这是一项核心的技术。这项技术诞生在河北科技大学，由韩春雨创就，将大大提高中国生物界的民族自信心。
韩春雨和他的团队
这次对韩的质疑已经到了不可理喻、思维混乱的地步。广泛的质疑也确实体现了韩相对高超的水平。希望中国生物界在韩春雨团队的鼓舞下，抛开基于民族自信缺乏的无逻辑质疑，赶紧认真向韩春雨学习，利用中国 NgAgo 暂时领先的机遇，做点后续发展完善工作。”
在2014年的Nature上曾有研究者报道了TtAgo(从Thermus thermophiles中纯化出的Argonautes蛋白)能够在5’端磷酸化的单链寡聚脱氧核糖核苷酸（5’P-ssDNA）的引导下对靶标的DNA进行切割。遗憾的是，这个反应发生的条件是65℃以上。这个反应温度的限制，就限制了这个系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑的可能性。
韩春雨团队首先将TtAgo和PfAgo（和TtAgo类似一种蛋白）的氨基酸序列在NCBI上进行比对，结果他们找到了另外一种来自haloalkaliphilic archaebacteriumN. gregoryi SP2的Argonaute。接着，他们首先验证了在体外NgAgo是否使用ssDNA引导来对DNA进行切割。 随后，他们在细胞水平检验了NgAgo是否可以作为基因编辑的工具。最后，他们通过将NgAgo-gDNA系统和Cas9-gRNA系统进行比较，来说明NgAgo-gDNA系统具有更广的适用性和更好的特异性。
总的来说，韩春雨团队所发现的NgAgo-gDNA系统相对于Cas9-gRNA系统主要具有以下优势：
    1、具有相当的基因编辑效率和更低的错配带来的脱靶效应
    2、靶标序列没有特殊要求，对于G+C丰富区域相对Cas9-gRNA编辑效率更高
    3、NgAgo蛋白分子量更小（887氨基酸vs. 1368氨基酸）
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无法重复可能是科研现状，好多人隐藏关键技术细节
   
韩春雨NgAgo基因编辑技术可重复性引起的“质疑风波”，但该领域有些专家认为“不能重复不意味着是假的。”
科学网发文，有关NgAgo基因编辑技术首篇论文实验的可重复性受到相关研究者质疑，该论文作者、河北科技大学副教授韩春雨在各类报告上回应这需要“高超的实验技巧”。
对此，《中国科学报》记者在采访该领域专家时了解到，所谓“高超的实验技巧”实为实验“标准化”，目前多个实验室的重复实验结果即将出炉。
最近一个月，许多研究者在网络平台上声称无法重复韩春雨发表论文中的实验。科学网上，多名博主转发研究者的评论，参与了对此事的关注。
截至发稿前，韩春雨本人并未就此事细节向媒体进行回应。不过，据《中国科学报》记者了解，世界范围内有几家实验室正在对NgAgo-gDNA基因编辑技术的几项实验进行重复，并且已有从未与韩春雨联系过的研究者独立完成了重复实验，即将在学术刊物上发表论文公布结果。
“韩春雨所说的‘高超的实验技巧’并不准确。”国内一名从事基因技术研究的院士告诉《中国科学报》记者。他推测，无法重复的原因可能是实验过程的“标准化”出了问题，“在细胞生物学的历史上，不能重复的实验时有发生，甚至有时候只是换了一个实验室地点，也得不到相同的实验结果。”
例如，该院士曾亲历，使用不同生产厂家的血清，也会影响哺乳动物细胞培养。而当年基因克隆时，法国科学家一直无法复制加拿大科学家的实验，最终查明原因竟源于两家实验室使用的水的区别。
因此，上述院士表示：“韩春雨的实验其他人不能重复不能代表这一结果是假的。”目前，已有研究者正在逐步发现“诀窍”。在专门讨论NgAgo的谷歌讨论小组中，一名无法证实身份的研究者“Jan Winter”表示，他因为替换了一项实验材料，取得了重复实验的成功。韩春雨的实验显示，NgAgo能够识别5’磷酸化的ssDNA并利用其作为向导，完成后续的编辑过程，而获得磷酸化的小段DNA是前提。
这名研究者则是在实验室用激酶磷酸化替代了从厂家直接订购，而取得了重复实验的成功。业内人士分析，磷酸化可能是实验中的技术要点之一。
哈尔滨工业大学生命学院教授黄志伟课题组向《中国科学报》记者证实，他带领的研究组正在重复这项实验。“结果还要再等一等。”他表示。
根据《中国科学报》记者调查，针对韩春雨论文的质疑集中在论文中的第四部分结果上，即证明NgAgo能否编辑内源人类基因组。
今天下午，一位来自印度基因与综合生物学研究所的Debojyoti Chakraborty博士向媒体确认“this system works”（这一系统奏效了）。Chakraborty博士表示，他们使用了NgAgo技术剪辑了海拉细胞中的相关序列，并观测到了细胞中的GFP减少的现象，这初步确认了剪辑技术发生了作用。他同时强调：“要判定韩教授的方法的可重复性，必须要等到基因测序结果出来以后才能下结论。”
对此，记者从可靠渠道了解到，韩春雨早在论文发表之初，便意识到，这一新技术目前并不稳定，他也一直致力于优化和改进该技术，并曾表示“很有信心”。目前，韩春雨已向相关研究者发放了质粒，用于NgAgo基因编辑技术的进一步研究。
现在，加拿大的”ETC Group”，”地球之友“（Friends of the Earth）,”食品与饮水观察组织“（Food & Water Watch）, ”有机食品消费者协会“（Organic Consumers Association）以及其他国际非政府组织从不同角度质疑转基因技术。